TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISME
A. PENDAHULUAN
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa
Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain.
Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut:
mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai.
mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.
Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.
Biakan Cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25 cm. Biakan Padat. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara.• Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api.
B. DASAR TEORI
-pewarnaan gram
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :
- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.
- Fiksasi olesan pada kaca objek.
- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005).
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri (Anonim, 2008):
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):
a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas (Irawan, 2008).
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan, 2008):
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa
Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain.
Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut:
mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai.
mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.
Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.
Biakan Cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25 cm. Biakan Padat. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara.• Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api.
B. DASAR TEORI
-pewarnaan gram
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :
- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.
- Fiksasi olesan pada kaca objek.
- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005).
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri (Anonim, 2008):
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):
a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas (Irawan, 2008).
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan, 2008):
IK
DISINI..!!
MINYAK
IMERSI
Obyektif 100x selalu memakai minyak imersi, antara lensa
dengan obyektif dengan gelas penutup. Pemakaian minyak imesi tersebut akan
memperbesar A.N, jadi berarti pula memperbesar limit daya pisah.
A.N. (Aperture Numerik) adalah factor yang menentukan besarnya “Airy Disc”, bayangan mikroskop, yaitu besarnya layar.
A.N= n sin u
N= indeks refraksi
U= sudut aperture
Karena udara mempunyai indeks refraksi 1, maka n dapat diabaikan bila menggunakan objektif kering. Karena minyak imersi mempunyai indeks refraksi kurang lebih 1,515 maka jelaslah mempergunakan minyak imersi, memperbesar A.N.
A.N. mempunyai hubungan langsung dengan limit daya pisah (“Resolving Power”) mikroskop, yaitu kemampuan maksimum mikroskop untuk membedakan dua buah titik terdekat sebagai terpisah.
Beberapa pabrik optic membuat minyak imersi secara sintetik, yang indeks biasanya telah diketahui misalnya 1,515. Sebaiknya minyak imersi tersebut tidak berfluoresensi ataupun tidak mengeras.
Walaupun kita mempergunakan minyak imersi yang tidak mengeras, namun setelah selesai memakai minyak imersi sebaiknya minyak tersebut dibersihkan memakai lap yang bersih atau kertas lensa.
A.N. (Aperture Numerik) adalah factor yang menentukan besarnya “Airy Disc”, bayangan mikroskop, yaitu besarnya layar.
A.N= n sin u
N= indeks refraksi
U= sudut aperture
Karena udara mempunyai indeks refraksi 1, maka n dapat diabaikan bila menggunakan objektif kering. Karena minyak imersi mempunyai indeks refraksi kurang lebih 1,515 maka jelaslah mempergunakan minyak imersi, memperbesar A.N.
A.N. mempunyai hubungan langsung dengan limit daya pisah (“Resolving Power”) mikroskop, yaitu kemampuan maksimum mikroskop untuk membedakan dua buah titik terdekat sebagai terpisah.
Beberapa pabrik optic membuat minyak imersi secara sintetik, yang indeks biasanya telah diketahui misalnya 1,515. Sebaiknya minyak imersi tersebut tidak berfluoresensi ataupun tidak mengeras.
Walaupun kita mempergunakan minyak imersi yang tidak mengeras, namun setelah selesai memakai minyak imersi sebaiknya minyak tersebut dibersihkan memakai lap yang bersih atau kertas lensa.
Untuk melihat salah satu bagian
preparat dengan jelas, dapat digunakan pembesaran yang lebih kuat. Putarlah
revolver untuk mengganti lensa objektif pembesaran lemah dengan lensa objektif
pembesaran kuat.
Catatan : Untuk pembesaran kuat (100
x) harus menggunakan minyak imersi (immersion oil) yang diteteskan di atas
preparat, dengan cara jauhkan dulu tabung/lensa objektif dari preparat kemudian
teteskan minyak imersi. Putar atau pasang lensa objektif 100x
dan turunkan lensa tersebut sampai menyentuh minyak imersi. Minyak imersi
berfungsi untuk menaikan indeks bias cahaya sehingga objek dapat terlihat
dengan lebih jelas.
Dan perlu diketahui pula bahwa gambar
berlawanan dengan arah preparat. Kalau slide preparat digeser ke kanan,
berarti slide di geser ke kiri dan sebaliknya. Ilustrasi seperti gambar di atas
(gambar 6).
Perbedaan dasar antara bakteri gram
positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.
Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif,
sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol
memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi
peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3
nm).
Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif,
sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol
memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi
peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3
nm).
Reagen-reagen
yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:
1. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri.
2. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama
1. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri.
2. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama
3. Ethanol 95% (secukupnya
sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukk melunturkan cat
utama
4. Safranin (1 tetes) sebagai
cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warna
cat utamanya
Pada saat pemberian larutan cat kristal violet,
bakteri gram positif dan negatif sama-sama berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif
terbentuk kompleks iodin kristal violet sehingga sel
berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan
etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif
luntur, sedangkan pada bakteri gram negatif tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan
kompleks violet kristal-iodin keluar sel, sedangkan pada
gram posotif dinding sel dehidrasi, pori berkerut dan permeabilitas rendah
sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara
dinding sel dan membran sitoplasm sehingga sel tetap
biru/ungu. Saat penambahan safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan
gram negatif melewatkannya.
Bakterig ram- p os itif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil
ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di
bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram-negatif akan
berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis
bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding
sel bakteri.
Bakterig ram- neg atif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri
gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka.
Banyak
spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka
berbahaya bagi
organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel
gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).
organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel
gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).
Bakteri gram-positif
antraks
(batang ungu) pada contoh cairan
serebrospina. Jika ada, bakteri spesies gram-negatif
akan berwarna merah muda. (Sel-sel lain adalah sel darah putih
(Gram Positif)
(Gram Negatif)
Coccobasili - Gram negatif
(Brucella abortus)
Vibrio - Gram negatif (Vibrio
cholerae)
Staphylococcus - Gram positif (Staphylococcus aureus)
Streptococcus - Gram positif
(Streptococcus pneumoniae)
Pembentuk
Spora - Gram positif (Clostridia spp)
Pewarnaan negative
muatan negatif,
maka pada sel yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel sehingga zat warna ini
akan berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi sel
dan bagian dalam sel akan tetap berwarna bening (Alcamo, 1996). Selain itu disebutkan juga pada
pustaka bahwa bakteri merupakan organisme mikroselular
yang pada dinding selnya mengandung ion negatif, zat warna (nigrosin) yang bermuatan negatif tidak akan mewarnai sel tetapi yang terwarnai
adalah lingkungan luarnya saja (Entjang, 2003).
Pada pewarnaan gram didapatkan hasil bahwa bakteri Streptococcus pyogenes dengan pembesaran 40x10 dan 100x10
berbentuk bulat (coccus) yang membentuk untaian rantai
dengan warna ungu. Warna ini menunjukkan bakteriStreptococcus
pyogenes
termasuk golongan bakteri gram positif. Hal ini disebabkan karena bakteri
menyerap zat warna
dasar yaitu kristal violet dan warnanya tidak terhapuskan oleh pencucian alkohol, sehingga sel
bakteri ini tidak menyerap warna sfranin yang merupakan
warna kontras (Ramona dkk, 2007). Warna violet (ungu) ini timbul karena bakteri gram positif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal dan
kandungan lipidnya rendah sehingga akan mengikat lebih
banyak kompleks zat warna sehingga warnanya menjadi
violet (ungu) (Alcamo, 1996). Pada pengamatan bakteriE.coli dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 didapatkan hasil bahwa bakteri ini
berbentuk batang (basil) dengan warna merah muda. Warna
ini menunjukkan bakteriE.coli termasuk
golongan bakteri gram negatif. Hal
ini disebabkan karena bakteri ini setelah diwarnai oleh
pewarna dasar yaitu kristal violet menyerap warna dasar, setelah dicuci dengan alkohol maka warna dasarnya akan terhapus dan menyerap pewarna
safranin atau karbol fushin yang digunakan sebagai
pewarna kontras sehingga akan berwarna merah (Ramona dkk,
2007). Warna merah ini timbul karena bakteri gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis sehingga ikatan antara kristal
violet-iodine dengan lapisan peptidoglikan lebih sedikit
terjadi dan bakteri lebih dominan terwarnai oleh pewarna
safranin yang berwarna merah (Alcamo, 1996). Pada pengamatan bakteri jenis Bacillus dengan pembesaran 40x10 dan
100x10 didapatkan hasil yang berbeda dimana terdapat
Bacillus yang berbentuk batang dengan warna ungu dan Bacillus yang berbentuk batang dengan warna merah. Perbedaan hasil ini disebabkan
karena kemungkinan pada saat pewarnaan dengan safranin
terlalu banyak dilakukan penambahan safranin sehingga
warnanya ikut terserap. Berdasarkan warna yang diperoleh
menunjukkan bahwa dua bakteri jenis bacillus yang diamati merupakan golongan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bacillus yang
termasuk golongan gram positif karena bakteri ini setelah
diwarnai dengan pewarna dasar kristal violet dan
dicuci alkohol tetap berwarna ungu dan tidak menyerap
pewarna kontras (Ramona dkk, 2007). Hal ini disebabkan
karena bakteri gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan kandungan lipidnya rendah sehingga akan mengikat
kompleks yang lebih banyak dan warnanya akan menjadi
violet (Alcamo, 1996). Untuk hasil bacillus bakteri gram negatif terjadi karena penambahan
safranin yang berlebihan sehingga warna safranin ikut
terserap, karena menurut pustaka disebutkan bahwa bacillus merupakan golongan bakteri gram positif (Waluyo, 2004).
Dalam pewarnaan gram dilakukan juga penambahan iodine
yang merupakan proses fiksasi warna untuk mempertahankan struktur dalam dan luar sel tetap
pada posisinya. Fiksasi juga berperan untuk
menginaktivasi enzim yang mungkin dapat mengganggu bentuk
sel dan menguatkan struktur mikroba. Mikroba umumnya dibunuh dan dilekatkan
kuat pada kaca objek selama fiksasi (Prescott et al, 1993).
IV. KESIMPULAN
1. Tujuan dilakukan
pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad,
mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat
reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia
jazad dapat diketahui.
2. Metode-metode
yang dapat digunakan dalam pewarnaan sel bakteri adalah pewarnaan langsung dengan pewarnaan basa, pewarnaan tidak langsung atau
pewarnaan negatif dengan pewarnaan asam, pewarnaan gram,
dan pewarnaan endospora. Tetapi dalam praktikum, tidak
dilakukan metode pewarnaan endospora.
3.Bentuk
bakteri hasil isolasi yang terlihat adalah coccus yang membentuk untaian rantai
(streptococcus) pada Streptococcus pyogenes, basil untuk bakteriE.coli
dan bacillus
4.Bakteri
gram positif mempunyai ciri berwarna ungu karena mengikat warna pada
pewarna dasar dan
tidak terhapus oleh pencucian dengan alkohol serta tidak menyerap pewarna kontras sedangkan bakteri gram
negatif mempunyai ciri berwarna merah karena menyerap
pewarna dasar dan terhapuskan oleh pencucian dengan alkohol serta menyerap
pewarna kontras. Pada praktikum ini bakteri Streptococcus pyogenes termasuk golongan
bakteri gram positif, E.coli termasuk golongan bakteri gram
negatif, dan bacillus termasuk golongan bakteri gram
positif.
DAFTAR PUSTAKA
Alcamo, I.E. 1996. Fundamental of Microbiology, 5th Edition. Addison Wesly Longman, Inc:
New
York
Entjang, I.
2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Citra Aditya
Bakti. Bandung.
Jawetz, E., J.L. Melnick, dan
E.A. Adelberg. 2005. Mikrobiologi kedokteran. Penerbit Buku
Kedokteran.
Jakarta.
Pelczar, M.J, E.C.S. Chan. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.
Prescott, Lansing M., John P. Harley, Donald A. Klein. 1993. Microbiology 2nd Edition USA:
Pelczar, M.J, E.C.S. Chan. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.
Prescott, Lansing M., John P. Harley, Donald A. Klein. 1993. Microbiology 2nd Edition USA:
WMC Brown Publisher.
Ramona, Y., R. Kawuri, I.B.G. Darmayasa. 2007.
Penuntun Praktikum Mikrobiologi Umum
Untuk Program Studi Farmasi FMIPA UNUD. Laboratorium
Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas
Udayana. Bukit Jimbaran.
Waluyo. L.2004. Mikrobiologi
Umum. UMM Press. Malang
